۳-۹ روش محاسبه limit of Quantification((LOQ: ۱۰ بار جذب بلانک را قرائت کرده و انحراف معیار آن را محاسبه میکنیم. سپس آن را در عدد۱۰ضرب کرده و بر شیب خط استاندارد مربوطه تقسیم میکنیم.
۳-۱۰ روش محاسبه خطای درون آزمایش یا (Within-Run Erorr)WRE:میانگین و انحراف معیار داده ها را بدست آورده و انحراف معیار را بر میانگین تقسیم کرده و در ۱۰۰ ضرب میکنیم. بدین ترتیب درصد انحراف استاندارد نسبی یا %SRD((%Relative Standard Deviation بدست می آید که همان WRE میباشد.
۳-۱۱ روش محاسبه درصد بازیابی:(Recovery) مقدار ماده مورد اندازه گیری آزاد شده در مرحله آخر را به مقدار همین ماده مورد اندازه گیری اضافه شده در مرحله اول تقسیم کرده وعدد حاصل را در ۱۰۰ ضرب میکنیم.
۳-۱۲ روش کار:
۳-۱۳ طریقه ساخت محلول stock
mg1 از پودر پاراکوات دی کلراید را با ترازوی چهار رقم اعشار وزن کرده و به آن۱۰۰۰میکرولیتر (cc1) آب مقطر دو بار تقطیر اضافه می کنیم تا به حجم mg/ml1 برسد، این محلول stock ماست
۳-۱۴ انواع آزمایشات:
۱٫رسم منحنی استاندارد پاراکوات دی کلراید در آب
۲٫رسم منحنی استاندارد پاراکوات دی کلراید بعد از مشتق سازی با معرف دی تیونیت سدیم ۰٫۱ درصد در سود M1
۳٫اندازه گیری پاراکوات در خون بدون استخراج
۴٫استخراج پاراکوات از محلول آبی با بهره گرفتن از رزین تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید (PCA)
۵٫استخراج پاراکوات از خون با بهره گرفتن از رزین PCA
۶٫استخراج پاراکوات از خون با بهره گرفتن از زئولیت کلینوپتیلولایت
۷٫اندازه گیری پاراکوات در پلاسما به روش معمول ( Jarvi and Stewart 1979)
۳-۱۵رسم منحنی استاندارد پاراکوات دی کلراید در آب
غلظت های ۲، ۵، ۱۰، ۱۵ و ۲۰ میکروگرم در میلی لیتر (working solutions ) از پاراکوات دی کلراید در آب مقطر را با بهره گرفتن از serid dilution از محلول ۱۰۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر (stock solution ) پاراکوات دی کلراید در آب مقطر می سازیم. طیف ماوراء بنفش ( ultra violet ) محلول ۱۰ میکروگرم بر میلی لیتر پاراکوات دی کلراید در آب مقطر را در محدوده nm 400-200 در مقابل آب مقطر(بلانک) می گیریم. این طیف دارای طول موج حداکثر جذب در nm257 می باشد. سپس جذب محلولهای استاندارد ۲، ۵، ۱۰ ،۱۵ و۲۰ میکروگرم بر میلی لیتر پاراکوات دی کلراید در آب مقطر رابعد ازواکنش با معرف دیتیونیت سدیم ۰٫۱%در سود ۱ مولار در طول موجnm 394.5 قرائت می کنیم. عمل ساخت غلظتهای استاندارد از stock solution های مختلف با غلظت ۱۰۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر و قرائت جذب در طول موج nm394.5 را سه بار انجام می دهیم تا بتوانیم منحنی کالیبراسیون (استاندارد) دقیق تری از پاراکوات دی کلراید رسم کنیم.
برای رسم منحنی استاندارد ، غلظت پاراکوات دی کلراید (محور x ها) را در مقابل جذب در طول موج nm394.5 (محور yها) رسم می کنیم.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۱۶ رسم منحنی استاندارد پاراکوات دی کلراید بعد از مشتق سازی با معرف دی تیونیت سدیم ۰٫۱ درصد در سود ۱مولار
به ml1 از غلظت های استاندارد پاراکوات دی کلراید در مرحله قبل، ml1 از معرف دی تیونیت سدیم اضافه می کنیم و طیف این محلول را در محدوده nm800-400 در مقابل معرف دی تیونیت سدیم (بلانک) می گیریم. این کمپلکس به رنگ آبی می باشد. این طیف دارای دو maxλ در nm394.5 و nm603 می باشد. سپس جذب هر کدام از محلولهای استاندارد فوق را در این دو طول موج قرائت می کنیم. عمل ساخت غلظت های استاندارد از stock solution های مختلف با غلظت ۱۰۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر و افزودن معرف دی تیونیت سدیم به آنها و قرائت جذب در طول موجهای nm394.5 و nm603 را سه بار انجام می دهیم تا بتوانیم منحنی استاندارد دقیق تری از پاراکوات دی کلراید رسم کنیم.برای رسم منحنی استاندارد پاراکوات دی کلراید کمپلکس شده با معرف دی تیونیت سدیم ، غلظت پاراکوات دی کلراید (محور xها) را در مقابل جذب در طول موجهای nm394.5 و nm603 (محور yها) بطور جداگانه رسم می کنیم.با توجه به جذب رزین تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید(PCA) و کلینوپتیلولایت در محدوده uv، از منحنی استاندارد پاراکوات دی کلراید مشتق سازی شده با معرف دی تیونیت سدیم در طول موج nm394.5 که جذب بیشتری نسبت به طول موج nm603 داشت، جهت اندازه گیری و بررسی های کمی پاراکوات استفاده می کنیم
۳-۱۷ اندازه گیری پاراکوات در خون بدون استخراج:
ml 6خون سیتراته را به ۶ قسمت یک میلی لیتری تقسیم کرده و غلظت های ۰، ۲ ، ۵، ۱۰ ، ۱۵ و ۲۰ میکروگرم در میلی لیتر پاراکوات دی کلراید را با بهره گرفتن از stock solution پاراکوات دی کلراید با غلظت g/mlµ ۱۰۰۰ در آنها ایجاد می کنیم. سپس به هر کدام از آنها ml1 اتانول اضافه می کنیم تا پروتئینهای خون رسوب کنند. سپس با دور RPM5000 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم و طیف غلظت µg / ml2 را در محدوده nm800-400 در مقابل نمونه خون بدون پاراکوات (بلانک) می گیریم. این طیف دارای یک maxλدرطول موجnm394.5 می باشد. سپس جذب محلولها در طول موج nm394.5 در مقابل بلانک قرائت می کنیم. عمل ساخت غلظتهای استاندارد در خون از stock solutionهای مختلف با غلظت µg/ml1000 و قرائت جذب در طول موج nm394.5 را سه بار انجام می دهیم تا بتوانیم منحنی استاندارد دقیق تری از پاراکوات دی کلراید در خون رسم می کنیم. برای رسم منحنی استاندارد، غلظت پاراکوات دی کلراید در خون رسم کنیم. برای رسم منحنی استاندارد غلظت پاراکوات دی کلراید در خون( محور xها) را در مقابل جذب در طول موج nm394.5 (محور yها) رسم می کنیم.
این منحنی را برای این رسم می کنیم که بتوانیم غلظت پاراکوات استخراج شده از خون توسط رزین تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید(PCA) و کلینوپتیلولایت را با بهره گرفتن از آن اندازه گیری کنیم.
۳-۱۸ استخراج پاراکوات از محلول آبی با بهره گرفتن از رزین تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید(PCA)
ابتدا ۱گرم PCA را سه بار با آب مقطر شستشو داده و محلول رویی را دور میریزیم سپس۵ml آب مقطر که حاوی ۲۰µg پاراکوات دی کلراید می باشد را به آن اضافه میکنیم و ۱۵دقیقه ورتکس می کنیم تا پاراکوات به خوبی جذب رزین شود سپس مخلوط را با دور ۵۰۰۰RPM به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم و به ۱ml از محلول رویی،۱mlمعرف دیتیونیت سدیم اضافه میکنیم و جذب آن را در ۳۹۴٫۵nm قرائت میکنیم و غلظت پاراکوات در محلول رویی را از روی منحنی استاندارد پاراکوات در آب مقطر بدست می آوریم.مقدار پاراکوات بر حسب میکروگرم در محلول رویی با ضرب کردن غلظت در حجم محلول رویی (۵ml) بدست خواهد آمد.با کم کردن این مقدار gµ۲۰ که مقدار پارکوات اولیه شده است،مقدار پاراکوات جذب شده به رزین PCA بدست خواهد آمد.
برای آزاد کردن(استخراج)پاراکوات جذب شده از PCA ، محلولی رویی را دور ریخته و به رسوب،۱ml محلول سدیم کلرید اشباع در آب مقطر می افزاییم و به مدت ۱۵ دقیقه ورتکس میکنیم،سپس مخلوط را با دور ۵۰۰۰RPM به مدت ۵دقیقه سانتریفیوژ میکنیم و به ۱ml از محلول رویی،۱ml معرف دی تیونیت سدیم اضافه میکنیم و جذب آن را در ۳۹۴٫۵nm قرائت میکنیم و غلظت پاراکوات در محلول رویی را از روی منحنی استاندارد پاراکوات در آب مقطر بدست می آوریم.مقدار پاراکوات آزاد شده در محلول رویی با ضرب کردن غلظت در حجم محلول رویی (۱ml) به دست خواهد آمد.در نهایت برای اندازه گیری میزان درصد بازیابی (Recovery) استخراج پاراکوات از محلول آبی توسط رزین PCA، مقدار پاراکوات آزاد شده در مرحله آخر را بر عدد۲۰ (مقدار پاراکوات اولیه اضافه شده به میکروگرم به رزین PCA) تقسیم کرده و حاصل را در عدد۱۰۰ ضرب میکنیم.
مراحل بالا را سه بار تکرار میکنیم تا بازیابی را به میزان دقیق تری محاسبه می نماییم.
۳-۱۹ استخراج پاراکوات از محلول آبی با بهره گرفتن از کلینوپتیلولایت:
ابتدا ۱گرم کلینوپتیلولایت را سه بار با آب مقطر شستشو داده و محلول رویی را دور میریزیم سپس۵ml آب مقطر که حاوی ۲۰µg پاراکوات دی کلراید میباشد را به آن اضافه میکنیم و ۱۵دقیقه ورتکس میکنیم تا پاراکوات به خوبی جذب کلینوپتیلولایت شود سپس مخلوط را با دور ۵۰۰۰RPM به مدت ۵دقیقه سانتریفیوژ میکنیم و به ۱ml از محلول رویی، ۱ml معرف دیتیونیت سدیم اضافه میکنیم و جذب آن را در ۳۹۴٫۵nm قرائت میکنیم و غلظت پاراکوات در محلول رویی را از روی منحنی استاندارد پاراکوات در آب مقطر بدست می آوریم.مقدار پاراکوات بر حسب میکروگرم در محلول رویی با ضرب کردن غلظت در حجم محلول رویی (۵ml) بدست خواهد آمد.با کم کردن این مقدار gµ۲۰ که مقدار پارکوات اولیه شده است،مقدار پاراکوات جذب شده به کلینوپتیلولایت بدست خواهد آمد.
برای آزاد کردن (استخراج) پاراکوات جذب شده از کلینوپتیلولایت ،محلولی رویی را دور ریخته و به رسوب، ۱ml محلول سدیم کلرید اشباع در آب مقطر می افزاییم و به مدت ۱۵ دقیقه ورتکس میکنیم، سپس مخلوط را با دور ۵۰۰۰RPM به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم و به ۱ml از محلول رویی، ۱ml معرف دی تیونیت سدیم اضافه میکنیم و جذب آن را در ۳۹۴٫۵nm قرائت میکنیم و غلظت پاراکوات در محلول رویی را از روی منحنی استاندارد پاراکوات در آب مقطر بدست می آوریم.مقدار پاراکوات آزاد شده در محلول رویی با ضرب کردن غلظت در حجم محلول رویی (۱ml) به دست خواهد آمد.در نهایت برای اندازه گیری میزان درصد بازیابی (Recovery) استخراج پاراکوات از محلول آبی توسط کلینوپتیلولایت ، مقدار پاراکوات آزاد شده در مرحله آخر را بر عدد۲۰ (مقدار پاراکوات اولیه اضافه شده به میکروگرم به کلینوپتیلولایت) تقسیم کرده و حاصل را در عدد۱۰۰ ضرب میکنیم.
مراحل بالا را سه بار تکرار میکنیم تا بازیابی را به میزان دقیق تری محاسبه می نماییم.
۳-۲۰ استخراج پاراکوات از خون با بهره گرفتن از رزین PCA:
ابتدا ۲گرم PCA را بطور جداگانه به ۲ لوله آزمایش افزوده و هر کدام را سه بار با ۵ml آب مقطر شستشو داده و با دور ۵۰۰۰RPM به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم و محلول رویی را دور میریزیم. سپس ۵mlخون سیتراته را به طور جداگانه به دو لوله آزمایش اضافه کرده و به هر دو لولهg 20µ پاراکوات دی کلراید می افزاییم .به هر دو نمونه خون ۵ml متانول می افزاییم تا پروتئین های خون رسوب کنند.سپس با دور ۵۰۰۰RPM به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم.محلول رویی هر کدام از لوله ها را به یک لوله حاویPCA شسته شده می افزاییم و۱۵ دقیقه ورتکس میکنیم سپس مخلوط را با دور ۵۰۰۰RPM به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم و به ۱ml از محلول رویی لوله اول ،۱ml معرف دیتیونیت سدیم در سود ۱M و به ۱ml از محلول رویی لوله دوم ،۱ml سود ۱M (بلانک) می افزاییم جذب لوله اول را در ۳۹۴٫۵nm در مقابل بلانک قرائت میکنیم و غلظت پاراکوات در محلول رویی را از روی منحنی استاندارد پاراکوات در خون بدست می آوریم .مقدار پاراکوات بر حسب میکروگرم در محلول رویی با ضرب کردن غلظت در حجم محلول رویی (۱۰ml) بدست خواهد آمد.با کم کردن این مقدار از ۲۰µgکه مقدار پاراکوات اولیه اضافه شده است،مقدار پاراکوات جذب شده به رزین PCA بدست خواهد آمد.
برای آزاد کردن (استخراج) پاراکوات جذب شده از PCA ،محلول رویی هر دو لوله را دور ریخته و به رسوب هر کدام از لوله ها ،۲ml محلول سدیم کلرید اشباع در آب مقطر می افزاییم و به مدت ۱۵ دقیقه ورتکس میکنیم سپس مخلوط را با دور ۵۰۰۰RPM به مدت دقیقه سانتریفیوژ میکنیم و به ۱ml از محلول رویی لوله اول ،۱ml معرف دی تیونیت سدیم و به ۱ml از لوله دوم ۱ml سود ۱M اضافه میکنیم و جذب آن را در ۳۹۴٫۵nm قرائت میکنیم و غلظت پاراکوات در محلول رویی را از روی منحنی استاندارد پاراکوات در خون بدست می آوریم.مقدار پاراکوات استخراج شده بر حسب میکروگرم در محلول رویی از روی منحنی با ضرب کردن غلظت در حجم محلول رویی (۲ml) بدست خواهد آمد. در نهایت برای اندازه گیری میزان درصد بازیابی استخراج پاراکوات از خون توسط رزین PCA ، مقدار پاراکوات آزاد شده در مرحله آخر را بر عدد ۲۰ (مقدار پاراکوات اولیه اضافه شده به میکروگرم خون) تقسیم کرده و حاصل را در عدد ۱۰۰ ضرب میکنیم.مراحل فوق را سه بار تکرار میکنیم تا بازیابی را به میزان دقیق تری محاسبه نماییم.
۳-۲۱ استخراج پاراکوات از خون با بهره گرفتن از زئولیت کلینوپتیلولایت:
این روش نیز دقیقا تمام مراحل آن مانند استخراج پاراکوات از خون با بهره گرفتن از رزین PCA است. دو لوله برداشته و به لوله شماره۱، یک گرم زئولیت اضافه می کنیم و به لوله شماره۲ هم یک گرم زئولیت اضافه می کنیم. و با ml5 آب مقطر ،۱۰ بار شست و شو می دهیم و هنگامی که محلول رویی شفاف شد ، جذب آن را می خوانیم. بعد محلول رویی هر دو لوله را دور ریخته و روی رسوب لوله اول ، محلول سرم+ پاراکوات۱(محتویات لوله شماره۳ ) را اضافه کرده و روی رسوب لوله دوم ، محلول سرم+ پاراکوات ۲(محتویات لوله شماره۴ ) را اضافه می کنیم. لوله اول ما شامل سرم بلانک است و لوله دوم شامل سرم+ پاراکوات.
لوله۱:سرم بلانک لوله۲:سرم+پاراکوات
لوله۳:سرم+پاراکوات+زئولیت۱ لوله۴:سرم+پاراکوات+زئولیت۲
بعد به تمامی لوله ها ، cc0.5 متانول اضافه می کنیم تا پروتئینهای موجود در سرم رسوب داده شوند، بعد هر۴ لوله را با دور RPM5000 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم، و تمامی محلولهای شفاف رویی را وارد لوله های ۱ تا ۴ دیگری می کنیم، حال دو لوله اول را کنار گذاشته و لوله سوم را به رسوب زئولیت۱ و لوله چهارم را به رسوب زئولیت۲ اضافه می کنیم و ۱٫۵ میلی لیتر آب مقطر به هر دو لوله اضافه کرده تا بخوبی ورتکس شود و ۱۵ دقیقه شیک کرده و باز هم با دور RPM5000 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم و جذب محلول رویی را می خوانیم. و در مرحله بعد cc0.5 معرف دی تیونیت سدیم را به لوله سرم + پاراکوات + زئولیت ۱ و cc0.5 سود یک مولار را به سرم + پاراکوات + زئولیت۲ اضافه می کنیم .باز در مرحله آخر این آزمایش هم مثل دفعات قبل برای آزاد کردن پاراکوات از PCA ، محلول رویی هر دو لوله(۳ و ۴) را دور ریخته و به رسوب هر کدام از لوله های سوم و چهارم، cc2 محلول NaCl اشباع در آب مقطر می افزاییم و به مدت ۱۵ دقیقه شیک کرده ، سپس مخلوط را با دور RPM5000 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم، و به ml1 از محلول رویی لوله اول، ml1 معرف دی تیونیت سدیم و به ml1 از لوله دوم، ml1 سود یک مولار می افزاییم و جذب هر کدام را این بار هم در دو طول موج λ ۳۹۴٫۵ وλ۶۰۳ قرائت کرده ودراینجاهم غلظت پاراکوات درمحلول رویی راازروی منحنی استانداردپاراکوات درخون بدست می آوریم. مقدارپاراکوات استخراج شده بر حسب میکروگرم در محلول رویی با ضرب غلظت در حجم محلول رویی (ml2) بدست خواهد آمد.
۳-۲۲ اندازه گیری پاراکوات در پلاسما به روش روتین( Jarvi and Stewart 1979) :
محلولهای استاندارد حاوی ۰، ۲ ، ۵ ، ۱۰ ، ۱۵ و ۲۰ میکروگرم در میلی لیتر پاراکوات در پلاسما تهیه می کنیم. حلال استخراج: ml50 ایزوبوتیل متیل کتون اشباع شده با آب را با ml50 ایزوبوتیل الکل اشباع شده با آب مخلوط کرده و سپس g0.5 سدیم دودسیل سولفات به آن می افزاییم.
روش کار:
۱) در یک لوله سانتریفیوژ ۱۵ میلی لیتری، ml2 آب مقطر و ml10 حلال استخراج را به ml2 پلاسما( محلول استاندارد) می افزاییم.
۲) به مدت ۵ دقیقه شیک می کنیم.
۳) به مدت ۵ دقیقه در دور RPM1500 سانتریفیوژ می کنیم.
۴) به دقت ml8 از فاز آلی را به لوله دیگری منتقل می کنیم که حاوی ml0.8 سدیم کلراید M2.5 می باشد
۵) به مدت ۵ دقیقه ورتکس کرده و سپس بمدت ۲ دقیقه در دور RPM1500 سانتریفیوژ می کنیم.
۶) فاز آلی را به دقت برمیداریم.