مطالعه انواع مختلف موجودات و روابط بین آنها علم سیستماتیک نامیده می‌شود. این بخش از علوم زیستی شامل مطالعه و بررسی طبقه‌بندی و تاکسونومی موجودات است. بطور سنتی اساس این علم بر پایه‌ی شباهت‌ها و تفاوت‌های مرفولوژیک در بین موجودات بنا گذاشته شده است، اما به بدلیل پیشرفت‌های شگرف دهه اخیر تغییرات قابل ملاحظه‌ای در این علم صورت گرفته است. از مهمترین این دلایل ورود تکنیک‌های جدید مولکولی از جمله آنالیز ایزوآنزیم‌ها، سیتوژنتیک مولکولی، ایمونولوژی، هیبریداسیون DNA- DNA و غیره به این عرصه از علم میباشد. در واقع در سیستماتیک مولکولی از ساختمان مولکولی موجودات به عنوان منبع اطلاعات سود جسته و از آن در بررسی روابط تکاملی آنها استفاده می‌نمایند. از مهمترین این تکنیک‌ها روش‌های مبتنی بر DNA است که زمینه تشخیص‌های دقیق و تفکیک گونه‌ها را میسر ساخته است. فیلوژنی مولکولی از چنین داده‌هایی در جهت ترسیم درخت روابط تکاملی موجودات استفاده می‌کنند.
از مهمترین موضوعات مورد استفاده در شناسایی شباهت‌ها و تفاوت‌ها، مقایسه توالیهای بین ژن‌ها با تکنیک ردیف سازی توالیها است. از کاربردهای دیگر فیلوژنی مولکولی، DNA barcoding است. در این روش گونه‌های مختلف یک موجود زنده با بهره گرفتن از بخش کوچکی از توالی DNA میتوکندری و یا ژن دیگری شناسایی میشوند. از کاربردهای دیگر این علم در ژنتیک انسانی است. با این روش‌ها میتوان هویت بچه‌ای را که پدر و مادر آن مورد شک هستند تعیین نمود. همچنین از این روش‌ها در علوم جنایی برای تعیین هویت اجساد و یا متهمین استفاده می‌شود. این روش معروف به انگشت نگاری DNA است.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
همه‌ی موجودات زنده دارای ماده‌ی ژنتیکی DNA، RNA و پروتئین هستند. این فاکتورها اساس مطالعات تکاملی را تشکیل می‌دهند. از آنجا که اساس مواد ژنتیکی نیز بر پایه‌ی توالی بازها یا نوکلئوتیدها بنا نهاده شده است. بنابراین موجوداتی که از لحاظ خویشاوندی به یکدیگر نزدیک باشند در ساختمان مولکولی‌شان شباهت‌های بسیار بالایی وجود دارد. این در حالی است که موجودات غیر خویشاوند از نظر این نوع ترکیبات با همدیگر متفاوتند. در حال حاضر توالی‌یابی تمام ژنوم یک موجود اوری بسیار گران قیمت است و این کار فقط برای تنها چند گونه صورت پذیرفته است. به هر حال تعیین توالی قسمت‌های معینی از کروموزوم‌های خاص امکان‌پذیر است. بطور کلی برای تجزیه و تحلیل سیستماتیک مولکولی گونه‌ها، توالی حدود ۱۰۰۰ جفت باز احتیاج است. در بررسی و مقایسه هر بخش از یک توالی در گونه‌های مختلف ممکن است اختلافاتی در بازها وجود داشته باشد و گونه‌هایی که به یکدیگر شبیه هستند اختلاف کمتری در نوکلئوتیدها داشته و توالی شبیه به هم خواهند داشت (حسینی، ۱۳۸۹).
۲-۸-۶- حشرات تراریخته
حشرات تراریخته[۴۲] حشراتی هستند که DNA موجودات دیگر را بطور مصنوعی به ژنوم آنها وارد نموده‌اند. مهندسی ژنتیک و اصلاحات انجام شده در اطلاعات ژنتیکی حشرات و کنه‌ها، برنامه‌های کنترل تلفیقی آفات را در آینده تحت تأثیر قرار خواهد داد. یکی از این اهداف شامل تغییر ژنتیکی در پشه‌ها و سایر حشرات ناقل بیماری در گیاهان، انسان و حیوانات است که قابلیت انتقال پاتوژن‌ها بیماریزا را به میزبان نداشته باشند. روش‌های تراریخته قادر به ارتقاء برنامه‌های کنترل ژنتیکی نیز خواهند شد. به عنوان مثال با ایجاد تغییرات ژنتیکی در جمعیت یک گونه فقط افراد نر بطور انبوه پرورش یابند و سپس با تابانیدن پرتوهای رادیواکتیو عقیم گردند. افراد عقیم شده پس از رهاسازی در طبیعت با افراد ماده وحشی در طبیعت جفت‌گیری نموده و نتیجه آن تخم‌های غیربارور خواهد بود. فقط تولید افراد نر عقیم یا فقط افراد ماده بوسیله روش‌های تراریخته، تأثیر و کارایی چنین برنامه‌هایی را ارتقاء خواهد داد. سایر اهدافی که توسط گروه‌های مختلف تحقیقاتی در حال انجام است تولید زنبوران عسل و کرم ابریشم مقاوم در برابر بیماری با داشتن ویژگی‌های اقتصادی مورد نظر میباشد. دشمنان طبیعی مورد استفاده در برنامه‌های کنترل بیولوژیکی جهت افزایش کارایی و تأثیرشان با روش‌های تراریخته قابل اصلاح هستند. از جمله این تغییرات میتوان به اصلاح در نسبت جنسی، میزان تحمل نسبت به دما و رطوبت محیط و دیاپوز اشاره کرد (حسینی، ۱۳۸۹).
۲-۹- میکروستلایت‌ها[۴۳] یا توالیهای ساده تکرار شونده[۴۴]
میکروستلایت‌ها یا ریزماهوارهها که به طور خلاصه SSR نامیده میشوند قطعاتی از DNA هستند که ۶-۱ باز متوالی تکرار می‌شود. به عنوان مثال توالی ریزماهوارهای که دو باز CA در آن ۱۲ بار تکرار می‌شود بصورت CACACACACACACACACACACACA است که در چنین حالتی توالی مکمل آن (GT)12 خواهد بود. ریزماهوارهها در ژنوم هسته و کلروپلاست و همچنین ژنوم میتوکندری بعضی از گونه‌ها یافت شده‌اند. تاکنون یافتن نشانگرهای ریزماهوارهای کاری بسیار زمان‌بر و پر هزینه بوده اما امروزه استفاده از این نشانگرها بخاطر وجود اطلاعات توالیهای متعدد در بانک‌های اطلاعاتی DNA نسبتاً کم هزینه‌تر شده است. روش عمومی مورد استفاده در جستجوی این نوع نشانگرها کلون کردن قسمت‌هایی از DNA بصورت کتابخانه ژنتیکی و سپس غربال نمودن این اطلاعات با کاوش‌های ریزماهواره است. کلون‌هایی که حاوی ریزماهواره هستند سپس جدا و نهایتاً توالی یابی میشوند. آغازگرهایی که ناحیه ریزماهواره را تکثیر می‌نمایند از روی بخش‌های غیر تکرار شونده توالی ریزماهواره طراحی می‌گردند. توالی‌هایی که این ریزماهوارهها را در بر می‌گیرد اغلب در بین گونه‌های نزدیک به هم ثابت است. این بدان معنی است که میتوان از آغازگرهای ریزماهوارهها برای چندین گونه استفاده نمود. ریزماهوارهها به مراتب سریع‌تر از انواع دیگری از توالیها جهش می‌یابند. میزان بالای پلی‌مورفیسم در ریزماهوارهها آنها را جهت بررسی‌های تنوع ژنتیکی افراد و جمعیتها مناسب می‌سازد (حسینی، ۱۳۸۹).
نشانگرهای ژنتیکی مبتنی بر میکروساتلیت‌ها در تمام نواحی ژنوم در هر دو بخش نواحی کد کننده و نواحی غیرکد کننده یوکاریوتها و پروکاریوت‌ها پراکنده شده است و واجد تمام شرایط مناسب یک نشانگر میباشد. میکروساتلیت‌ها توالیهای کوتاه تکراری مونو، دی، تری، تترا، پنتا و هگزا نوکلئوتیدی همچون (A)n، (CA)n، (GA)n، (GTA)n، (ATT)n، (GATA)n، (ATTTT)n، (ACGTCG)n میباشند.
ریزماهوارهها در ژنوم تمام یوکاریوتها وجود دارند. این نشانگرها به دلیل فراوانی زیاد، برای مکان‌یابی ژنتیکی و مطالعه جمعیتها، نشانگرهای ایدهآلی هستند. در موجودات عالی (نظیر گیاهان) قسمت زیادی از ماده وراثتی DNA قابل نسخه برداری نیست. زیرا دارای آغازگر، محل اتصال ریبوزومی[۴۵] و پایانگر[۴۶] نیست. بنابراین این قطعات توسط آنزیم های نسخهبردار، رونوشت برداری نمیشوند. برای این قسمت ها وظیفه‌ای شناخته نشده است، گرچه برخی محققین وظایف بسیار مهمی برای آنها قائل هستند. گاهی این قسمت ها حاوی توالیهای تکرار شوندهای هستند که چند صد جفت باز دارند. این توالیها که معمولاً در نواحی سانترومری کروموزومها دیده میشوند، ماهواره[۴۷] نامیده میشوند. در موارد دیگر یک توالی مرکزی ۶۰-۱۰ جفت بازی چند صد بار تکرار می شود. به این توالیها ماهوارک[۴۸] گفته می شود. ریزماهوارهها شامل واحدهای ۶-۱ تایی هستند که به دفعات تکرار میشوند. ریزماهوارهها یا همان توالیهای تکراری ساده در سراسر ژنوم پراکنده هستند. تعداد تکرار هر واحد تکرار شونده متفاوت است، ولی حداقل تکرار آن در ریزماهوارههای با هسته دو نوکلئوتیدی۱۰ بار و در ریزماهوارهای با هسته سه نوکلئوتیدی۷ بار برآورد شده است.
بر اساس توالیهای تکرار شونده ریزماهوارهها به ۳ دسته تقسیم میشوند:
الف) ریزماهوارههای کامل[۴۹]: در این نوع ریزماهوارهها یک واحد ریزماهواره کامل و پشت سر هم مانند GTGTGTGTGTGT بدون هیچ گونه تداخلی دیده میشوند.
ب) ریز ماهواره‌های ناقص[۵۰]: در این نوع ریزماهوارهها در درون واحدهای ریزماهوارهای یک یا دو نوکلئوتید غیر ریزماهوارهای مشاهده می‌شود که در ساختمان ریزماهواره تداخل ایجاد می‌کند مانند GTGTGTCGTGTGT.
ج) ریز ماهواره مرکب[۵۱]: در این نوع ریزماهوارهها دو ساختار ریزماهوارهای پشت سر هم قرار داشته و یا یکی درون دیگری قرار می‌گیرد مانند GTGTGTGTGCGCGCGC.
این تنوع در تعداد توالیهای ریزماهواره، به کمک PCR و الکتروفورز روی ژل پلی‌اکریلامید به خوبی قابل بررسی است. علل مختلفی برای تنوع زیاد تعداد ریزماهوارهها در افراد مختلف یک جمعیت ذکر شده است. در یکی از نظریه‌های بسیار مهم چنین گفته می شود. که تغییر در توالیهای ریزماهوارهای بیشتر به علت خطاهای ناشی از همانندسازی آنزیم پلیمراز است. نکته بسیار مهم و اساسی در مورد ریزماهوارهها این است که این توالیها دارای دو توالی منحصر به فرد در دو سمت خود[۵۲] هستند که معمولاً ثابت و حفاظت شده[۵۳] میباشند ولی تعداد تکرار واحدها درون محدوده این دو توالی بسیار متغیر است.
این توالیها در گونه های خویشاوند ثابت مانده و تغییراتی را متحمل نمیشوند. بنابراین اگر بتوان توالی دو طرف ریزماهواره را شناسایی نمود میتوان بر اساس آن آغازگرهایی را طراحی کرد و به کمک PCR قطعه ریزماهواره را تکثیر نمود. البته سختترین و پرهزینهترین قسمت کار نشانگرها تعیین توالی قسمت های دو طرف ریزماهوارهها میباشد. این مطالعات درگیاهان مختلف و با صرف وقت و هزینه های زیاد انجام میپذیرد. ریزماهوارهها تنوع زیادی دارند و به طور مناسبی در ژنوم گیاهان پخش شده اند و تعداد آنها نیز در ژنوم گیاهان نسبتاً زیاد است. کارکردن با ریزماهوارهها نسبتاً ساده است و میتوان به راحتی نتایج حاصله را تفسیر نمود، مخصوصاً امروزه نرم‌افزارهای مختلف رایانهای کمکهای شایانی به محققین نموده است. نشانگرهای ریزماهواره از دسته نشانگرهایی هستند که میتوانند به راحتی تفاوت بین افراد هموزیگوت و هتروزیگوت را نشان دهند[۵۴] و به کمک آنها میتوان آللهای مختلف را شناسایی نمود. با توجه به این خصوصیت مهم و چند شکلی بالا، امرزه از این نشانگرها به وفور استفاده می شود. نشانگرهای ریزماهواره بر اساس نحوه طراحی آغازگرها تقسیم بندی میشوند. در یک دسته آغازگرها به نحوی طراحی میشوند که ریزماهوارهها ازدیاد شوند ولی در دستههای دیگر نواحی بین ریزماهوارهای ازدیاد می شود. امروزه روش‌های زیادی برای شناسایی چند شکلی جایگاههای ریزماهوارهای و همچنین جایگاههای میان ریزماهوارهها وجود دارد. در یکی از اولین روش‌ها که به نام PCR تکرارهای کوتاه پیاپی[۵۵] مشهور است، از نواحی مجاور ریزماهواره که معمولاً حالت ثابت دارند، جهت طراحی آغازگر استفاده می شود. تکرارهای کوتاه پیاپی قطعاتی چند نوکلئوتیدی هستند که به طور پیاپی تکرار میشوند و نمونه بارز آن، ریزماهوارهها هستند. بنابراین پس از انجام واکنش PCR، ناحیه وسط این دو آغازگر که در واقع یک توالی تکراری ساده است ازدیاد می‌شود. بسته به تعداد تکرارهای انجام شده، چند شکلی متفاوتی روی ژلهای پلی‌اکریلامید مشخص می‌شود و میتوان آللهای متفاوتی را مشاهده نمود. چنین فرض می‌شود که جهش در تعداد واحدهای تکرار شونده و ایجاد چند شکلی بالا در ریزماهوارهها با یکی از دو مکانیزم کراسینک‌اور نامساوی[۵۶] یا جفت نشدن ناشی از سر خوردن در طول رشته[۵۷] (خطاهای همانندسازی DNA[58]) انجام می‌گیرد.
ریزماهوارهها اغلب چند شکلی بالایی دارند. آنها تک لوکوس بوده و دارای سیستم چندآللی و توارث همبارز هستند. در ژنوم یوکاریوتها به وفور یافت میشوند. چون مقدار بسیار اندک DNA برای بررسی ریزماهوارهها کفایت می کند بنابراین نمونه گیری از موجودات بدون از بین رفتن آنها امکان پذیر می شود. قابلیت تکرار پذیری بالا، امتیازدهی آسان و دقیق، تبادل آسان داده ها در بین آزمایشگاهها و گزینش بدون ابهام آللها از مزایای دیگر ریزماهوارهها هستند.
از معایب ریزماهوارهها میتوان به صرف وقت و هزینه زیاد در مرحله ایجاد و شناسایی، استفاده از مواد خطرناک (مثل اکریل امید و مواد رادیو اکتیو)، دانش اندک در مورد نحوه جهش و لزوم ایجاد روش‌های جدید برای تجزیه و تحلیل داده ها اشاره کرد. دیگر این که شناسایی ریزماهوارهها نیاز به کلون‌سازی و تهیه کتابخانه ژنومی دارد.
۲-۱۰- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری
ISSR نشانگر DNA مبتنی بر PCR برای تحقیق در روابط ژنتیکی بسیاری از جمعیتها و کالتیوارهای گیاهی و جانوری استفاده شده است (Zietkiewics et al., 1994; Prevost and Wilkinson, 1990; Tsumura et al., 1996; Deshpande et al., 2001; Bornet et al., 2002). در روش ISSR تکثیر قطعه DNA بین دو ناحیه تکراری ریزماهواره مشابه، در دو جهت مختلف صورت می‌گیرد. این تکنیک ریزماهواره‌هایی با طول ۱۶ الی ۲۵ جفت باز را به عنوان آغازگر در واکنش PCR تک آغازگره استفاده و چندین جایگاه ژنی عمدتاً توالیهای بینابینی با اندازه‌های مختلف را تکثیر می‌کند. توالیهای ریزماهوارههای مورد استفاده به عنوان آغازگر می توانند دی نوکلئوتید، تری نوکلئوتید، تترا و پنتا نوکلئوتید میباشند (Gupta et al., 1994; Meyer et al., 1993).
آغازگرها ممکن است در یکی از دو انتهای ۳َ یا ۵َ با ۱ تا ۴ باز دژنره شده انکورد شوند. این تکنیک بیشتر مزایای آنالیز ریزماهوارهها و AFLP را همراه با آغازگرهای اختیاری RAPD ترکیب می‌کند. ISSR به دلیل کاربرد آغازگرهای طولانی‌تر (۱۶ تا ۲۵ مری) از نشانگر RAPD (با آغازگر ۱۰ مری) تکرار پذیری بیشتری دارد و کاربرد دمای بالای اتصال آغازگر به نمونه DNA در مقایسه با نشانگر RAPD به قدرت باندی بالاتری منجرب شده است.
مطالعه روی تکرار پذیری نشان داد که تنها باندهای کمرنگ‌تر تکرار پذیرند. حدود ۹۲ تا ۹۵ درصد قطعات نمره داده شده در یک نمونه DNA در یک کالتیوار با PCR جدا در روی ژل اکریلامید تکرار میشوند (Fang and Roose., 1997; Fang et al., 1997; Moreno et al., 1998).
۱۰ نانوگرم نمونه DNA همان کارایی را در مورد فراورده‌های تکثیر شده نشان داد که نمونه‌های ۲۵ و ۵۰ نانوگرمی در مخلوط واکنش ۲۰ میکرولیتری از خود نشان دادند. دمای اتصال آغازگز به محتوای بازهای G+C بستگی دارد و در مورد آغازگرهای ISSR بین ۴۵ تا ۶۵ درجه سلیسیوس متغیر است.
ISSR نشانگر غالب بوده و از قوانین ساده مندل تبعیت می‌کند (Gupta et al., 1994; Tsumura et al., 1996; Ratnaparkhe et al., 1998; Wang et al., 1998) با وجود این در برخی موارد هم بارز نشان داده شده است که می‌تواند هوموزیگوزیتی را از هتروزیگوزیتی متمایز سازد (Akagi et al., 1996; Wang et al., 1998; Sankar and Moore, 2001). این نشانگر با واژه‌های مختلف توسط محققین مختلف معرفی شده است (جدول ۲-۱)
| جدول ۲-۱: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR | |
| اصطلاح استفاده شده | منبع |
| MP-PCR, Microsatellite primed PCR (refers to unanchored primer) | Meyer et al. (1993) |
| SSR-anchored PCR, Inter-SSR amplification | Zietkiewicz et al. (1994) |
| SPAR (single primer amplification reaction) | Gupta et al. (1994) |
| RAMPs (random amplified microsatellite polymorphisms) | Wu et al. (1994) |
| RAMs (randomly amplified microsatellites) | Hantula et al. (1996) |
| AMP-PCR (anchored microsatellite primed PCR) | Weising et al. (1998) |
