مرحله سوم: محلول فوق به مدت 5 دقیقه با سرعت 7000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید.
مرحله چهارم: مایع رویی به آرامی جدا گردیده و رسوب حاصله نگه داشته شد.
مرحله پنجم: 3 میلی­لیتر بافر جداکننده، به رسوب حاصله اضافه شد و تکرار مراحل 3 تا 5 تکرار گردید تا یک رسوب کاملاً سفید به دست آمد.
مرحله ششم: 3 میلی­لیتر بافر لیز کننده به رسوب اضافه و ورتکس شد (جهت جلوگیری از شکستن دی. اِن. اِی زمان ورتکس کاهش داده شد).
مرحله هفتم: در این مرحله مقدار 200 میکرولیتر SDS^[99]10 درصد و 10 میکرولیتر آنزیم پروتئیناز K (با غلظت 50 میکروگرم بر میلی­لیتر) به محلول حاصله اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای 65 درجه سانتی ­گراد در حمام آب گرم (بن ماری) قرار داده شد تا هضم محتویات هسته گلبول­های سفید کامل شد.
مرحله هشتم: یک میلی­لیتر محلول NaCl اشباع (تقریباً 6 مولار) به محلول اضافه گردیده و سپس محلول به مدت 15 ثانیه تکان داده شد.
مرحله نهم: محلول مزبور به مدت 15 دقیقه با سرعت 2500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی به یک لولۀ پلاستیکی استریل دیگر انتقال داده شد (در این مرحله پروتئین­های اتصالی به اسیدهای نوکلئیک همراه با نمک در انتهای لولۀ رسوب سفید رنگی تشکیل داد).
مرحله دهم: هم حجم محلول، کلروفرم اضافه و با تکان دادن با محلول مخلوط شد. سپس به مدت 10 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید (آلودگی­ها و پروتئین اضافی در این مرحله جدا شدند).
مرحله یازدهم: فاز آبی که در بالا تشکیل شد حاوی دی. اِن. اِی بود که با احتیاط جدا شد و به لولۀ پلاستیکی جدیدی انتقال داده شد.
مرحله دوازدهم: برای متراکم­تر نمودن رشته­ های دی. اِن. اِی به اندازه 1/. حجم محلول، استات سدیم 3 مولار (PH=5/2) اضافه شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

مرحله سیزدهم: دو برابر حجم محلول به دست آمده، اتانول مطلق^[100] سرد اضافه شد و لوله به آهستگی چند بار وارونه شد تا رشته­ های دی. اِن. اِی ظاهر گردیدند.
مرحله چهاردهم: کلاف دی. اِن. اِی را با میلۀ شیشه ­ای جمع­آوری کرده و به مدت حدود 5 تا 10 دقیقه در مجاورت هوا خشک گردید.
مرحله پانزدهم: دی. اِن. اِ حاصله دو بار با اتانول 70 درصد، شستشو داده شد و نهایتاً در 100 تا 200 میکرولیتر آب، حل گردید.
مرحله شانزدهم: تیوپ­های حاوی دی. اِن. اِ به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی ­گراد نگهداری شد تا دی. اِن. اِی به خوبی حل شد. سپس به دمای 20- درجه سانتی ­گراد انتقال داده شد.
3-5 تعیین کیفیت و کمیت دی. اِن. اِی استخراج شده
در برخی از مطالعات ژنومی از جمله کار با ریزماهواره­ها کیفیت دی. اِن. اِی اهمیت زیادی دارد و به خلوص بالایی نیاز است. مقدار دی. اِن. اِی مورد تکثیر نیز مهم است و برخی از مطالعات، مانند هضم آنزیمی و نشانگر رپید، مقدار دی. اِن. اِی بسیار حساس بوده و به مقدار بسیار جزئی نیاز دارند. از این رو پس از استخراج لازم است کیفیت و کمیت دی. اِن. اِی استخراج شده، تعیین گردد. برای تعیین مقدار دی. اِن. اِی روش­های زیادی وجود دارد ولی دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز بر روی ژل آگارز، معمول­تر می­باشند. از هر دوی این روش­ها اطلاعاتی راجع به کیفیت و خلوص دی. اِن. اِی به دست می ­آید (کارپ^[101] و همکاران، 1998).
3-5-1 روش اسپکتروفتومتری
از این روش به طور متداول برای تعیین خلوص و مقدار اسیدهای نوکلئیک در نمونه­ها استفاده می­ شود. اسیدهای نوکلئیک با ترکیبی از 4 نوکلئوتید، عمدتاً نور فرابنفش با طول موج 260 نانومتر را جذب می­ کنند. پروتئین­ها که متداول ترین آلوده­کننده­ های اضافی در نمونه­های DNA و RNA می­باشند، نور فرابنفش را در دو طول موج 260 و 280 نانومتر جذب می­ کنند. زنجیره­های پلی­پپتیدی که معمولاً دارای 3 اسید آمینه حلقوی باشند طول موج 280 نانومتر را بهتر جذب می­ کنند. اما برخی دیگر از پروتئین­ها مانند هیستون­ها و یا پروتامین­ها که فاقد و یا دارای تعداد اندکی از اسیدآمینه­های حلقوی می­باشند در طول موج 20 نانومتر فاقد و یا دارای حداقل جذب نوری می­باشند. نسبت طول موج 260 به 280 نانومتر بایستی در دامنه 2-8/1 باشد که بیانگر کیفیت مناسب DNA می­باشد. تعین غلظت DNA بر این اساس است که هر یک واحد جذب در طول موج 260 نانومتر متناظر با حدود 3/43 نانوگرم در یک سی­سی از DNA دو رشته­ای در یک چاهک، است.
یکی از پیشرفت­هایی که در زمینه دستگاه­های اسپکتوفتومتری صورت گرفته، ساخت نانو دراپ می­باشد. این دستگاه سرعت پردازش بالایی دارد و توانایی اندازه گیری طیف مرئی و UV را دارد و برای اندازه ­گیری، فقط به 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه مورد نیاز است. به علاوه در اندازه ­گیری به این روش به وسایل دیگری به جزء سر میکروپیپت نیازی نیست. نانودراپ همچنین برای اندازه ­گیری غلظت پروتئین و رنگ­های فلورسنت به کار می­رود.
شکل 3-1 دستگاه نانودراپ
اسپکتروفتومتر نانودراپ^[102]، این دستگاه بدون نیاز به چاهک و تنها با بهره گرفتن از 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه قادر است در زمانی کمتر از 10 ثانیه کلیه طول موج­های موجود در طیف مورد نظر را با دقت 1 نانومتر ، اسکن نماید و غلظت یا جذب نوری ماده مورد نظر را نیز تعیین کند (شکل 3-1). با توجه به سرعت بسیار بالای دستگاه و میزان کم نمونه مصرفی، کاربران این دستگاه قادر خواهند بود ضمن صرفه جویی در زمان و هزینه، بسیاری از آزمایشات ژنومیکس، پروتئومیکس و بیوشیمی را کنترل کیفی و بهینه نمایند. از دی. اِن. اِی که استخراج شد و با آب حل گردید، 2 میکرولیتر از آن برداشته و در داخل دستگاه قرار دادیم، میزان جذب نوری در طول موج­های 260 و 280 نانومتر اندازه گیری شد. غلضت دی. اِن. اِی بر حسب نانوگرم نیز به دست آمد، غلظت به دست آمده رقم بالایی را نشان می­داد که نیاز به رقیق شدن داشت و با نسبت مشخصی با آب دو بار تقطیر رقیق شد. به طور مثال در برخی نمونه غلظت تا 4000 نانوگرم هم مشاهده گردید که به 100 تا 200 نانوگرم رقیق شد.
3-5-2 روش الکتروفورز
بهترین روش­هایی که امروزه برای جداسازی ماکرومولکول­های زیستی به کار می­روند بر پایه فرآیندهای فیزیکی استوار می­باشند زیرا با این روش­ها حداقل تغییر در ساختار مولکول صورت می­گیرد و در نتیجه مولکول حداکثر فعالیت زیستی خود را حفظ می­نماید. بسیاری از روش­های جداسازی بر پایه خصوصیات زیستی، شیمیایی یا میان­کنش مولکول­های مورد مطالعه استوار است ( به عنوان مثال، کروماتوگرافی جذبی و روش­های ته­نشین سازی) (بهزادی و بهزادی، 1386).
3-5-2-1 تهیه بافر TBE برای الکترو فورز
3-5-2-1-1 تهیه 100 میلی لیترX 10 TBE
1- 78/10 گرم تریس بدون (Tris base) Hcl، 74/. گرم EDTA و 5/5 گرم اسید بوریک.
2- مواد را در ارلن ریخته و حجم را با آب دوبار تقطیر به 100 میلی­لیتر رسانده و کاملاً حل گردید.
3- محتویات ارلن را اتوکلاو کرده، بدین ترتیب بافرx 10 TBEبه دست آمد.
4- برای تهیه بافرx 1TBE، مقدار 100 میلی­لیتر بافر x10TBE را در یک سیلندر 1000 میلی­لیتر ریخته و با آب مقطر حجم آن به 1000 میلی­لیتر رسانده شد.
3-5-2-1-2 تهیه بافر بارگیری x6
برای تهیه 1 سی­سی از این بافر:
4/. گرم ساکارز، 0025/0 گرم بروموفنل و 0025/. گرم زایلن سیانول را در تیوپ 5/1 سی­سی ریخته و 1 سی­سی آب مقطر به آن اضافه کرده و به خوبی ورتکس تا کاملاً محتویات حل شده و محلول همگنی به دست آمد.
3-6 مراحل آماده سازی ژل آگارز
1- مرحله ابتدایی الکتروفورز تهیه ژل آگارز 5/1 درصد است به این صورت که برای حدود بیش از 10 نمونه، حدود 6/. گرم از پودر آگارز را درون ارلن ریخته و حدود 40 سی­سی بافر x5/0TBE روی آن ریخته شد.
2- حدود 30 ثانیه درون ماکروویو قرار داده تا پودر آگارز به خوبی درون x5/0TBE حل شد.
3- ارلن حاوی محلول را در زیر هود قرار داده تا دمای آن کاهش یافت.
4- پس از سرد شدن محلول داخل ارلن، حدود 1 مایکرو از Safe stain (ماده قهوه­ای رنگ) را جهت رنگ­آمیزی به آن افزوده و سپس آن را به آرامی تکان، تا به خوبی حل شد.
5- در نهایت به آرامی محلول را به درون آن ریخته و بدون حرکت در زیر هود حدود 20 دقیقه گذاشته تا ژل سفت گردید. ژل را به آرامی درون دستگاه الکتروفورز قرار داده شد. این نکته حائز اهمیت که TBE موجود در دستگاه باید کاملاً سطح ژل را بپوشاند.
6- پس از آماده ­سازی ژل و قرار دادن آن در دستگاه باید 3 الی 4 میکرولیتر از هر نمونه را به­ طور جداگانه با 1 میکرولیتر بافر بارگیری (لودینگ) کاملاً مخلوط کرده و سپس هر نمونه را به­ طور جداگانه درون چاهک­ها ریخته شد. عملکرد بافر بارگیری به این صورت است که حرکت نمونه­ها را بر روی ژل آسان می­ کند.
7- پس از قرار دادن نمونه­ها داخل چاهک برای تعیین وزن مولکولی نمونه­ها از نشانگرهایی با وزن مولکولی مشخص استفاده شد.
8- تانک الکتروفورز را به جریان برق وصل کرده، اختلاف پتانسیل 90 ولت و زمان 40 تا 45 برای ارزیابی کیفیت DNA و 75 دقیقه برای ارزیابی عملکرد PCR استفاده شد.
پس از اتمام زمان تعریف شده برای دستگاه، جریان برق را قطع کرده ژل را درون دستگاه ژل­داک قرار داده و نتایج ا مورد بررسی قرار گرفت.
3-7 واکنش زنجیره­ای پلیمراز
3-7-1 اجزاء واکنش PCR
جهت تکثیر قطعه 283 جفت بازی گیرنده­ی یک ژن دوپامین یک جفت آغازگر رو به جلو و برگشتی بر اساس توالی­های زوا و همکاران (2010) طراحی گردید. طول آغازگر رو به جلو و برگشتی به ترتیب 22 و 23 نوکلئوتید طراحی شد. آغازگرهای ذکر شده از شرکت تکاپوزیست با OD 2 تهیه شد. توالی آغازگرها به شرح زیر می­باشند:
F:5ˊ- CACTATGGATGGGGAAGGGTTG -3´
R: 5ˊ- GGCCACCCAGATGTTGCAAAATG-3ˊ
واکنش زنجیره­ای پلی­مراز نمونه­های خونی پس از استخراج DNA با ترکیب مواد در جدول 2-3 (به ترتیب) در یک میکروتیوپ 5/1 میکرولیتر انجام گرفت (میزان آب استریل برداشته شده بستگی به حجم دی. اِن. اِ مورد استفاده دارد).
جدول 3-1 ترکیب مواد واکنش زنجیره­ای پلیمراز