پتاسیم دی هیدروژن فسفات

۱

منیزیم سولفات

۵/۰

شکل ۳-۳: محیط کشت مایع تلقیح شده با مخمر
۳-۶-۲-۲- محیط کشت جامد
محیط کشت جامد بر روی پتری دیش^[۶۶] یا لوله آزمایش تهیه می شود. محیط کشت با ترکیبات ذکر شده در جدول ۳-۳با اضافه کردن ۲۰ گرم بر لیتر آگار، درون ارلن مایر تهیه و سپس حرارت داده شد تا مایع شفافی بدست آید. سپس از محلول تهیه شده درون لوله آزمایش (یک سوم حجم لوله آزمایش) ریخته و درب آن با پنبه، تنظیف و فویل آلومینیومی پوشانده شد و در اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه سترون گردید. پس از آن لوله ها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق به صورت شیب دار قرار داده شد تا کاملاً جامد شده و سطح شیب داری برای تلقیح میکروارگانیسم حاصل شود. سپس تحت شرایط سترون در کنار شعله عمل تلقیح انجام گردید و در انکوباتور در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد قرار داده شد تا میکروارگانیسم ها رشد کنند. برای تهیه محیط کشت بر روی پتری دیش پس از استریل شدن، لایه نازکی از محیط کشت داخل پتری دیش ریخته شد طوری که کل سطح آن را در بر گیرد. سپس در دمای اتاق قرار داده شد تا جامد شده و پس از آن تلقیح انجام گردید. برای تلقیح میکروارگانیسم روی محیط کشت جامد از لوپ^[۶۷] استفاده شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۷- بیورآکتور سینی دار
بیورآکتور سینی دار از جنس پلکسی گلاس^[۶۸] و با ابعاد ۵۵×۳۵×۴۵ سانتی متراستفاده شد (شکل ۳-۴). این بیورآکتور متشکل از سه سینی آلومینیومی بوده که به صورت افقی در بیورآکتور قرار می گرفت. ابعاد سینی های بالایی و میانی که به صورت مشبک طراحی شده بود ۵۵×۳۵×۴۵ سانتی متر بوده که بر روی سطوح آن ها باگاس مرطوب شده با مخمر قرار گرفت. اما سینی پایینی که در کف بیورآکتور واقع شده بود دارای ابعاد ۵۰×۳۰×۴۰ سانتی متر بوده و حجم داخلی آن با محیط کشت فاقد قند پر شد. سینی ها در داخل بیورآکتور در فواصل مساوی از هم قرار داشتند (۸/۱ سانتی متر). افزون بر این، سطوح سینی های بالایی و میانی با پارچه مرطوبی که به عنوان سطح خنک کننده عمل می کرد پوشیده شد. علاوه بر آن، این امر مانع از گرفتگی منافذ حاصل از وجود ذرات ریز سوبسترا بر روی سطوح سینی ها می شد. به منظور کنترل درجه حرارت داخلی بیورآکتور یک لامپ رشته ای که به کنترلر دیجیتالی دما متصل بود در دیواره کابین نصب شد. محلول مغذی موجود در سینی پایینی توسط یک پمپ پریستالتیک به گردش درآمده و با بهره گرفتن از یک نازل که در قسمت بالایی بیورآکتور قرار داشت با دبی ثابتی به طور یکنواخت بر روی سطح سینی بالایی توزیع گردید. این پمپ به یک کنترلر رطوبت متصل بوده و محلول مغذی پس از گذر از بستر جامد سینی بالایی از منافذ سینی عبور کرده و به سطح سینی میانی نیز منتقل شد. هم چنین برای این که درجه حرارت در تمام نقاط بیورآکتور به طور یکنواخت توزیع شود ۴ فن کوچک در میان سینی های بالایی نصب شد. نمای شماتیک بیورآکتور در شکل ۳- ۵ نشان داده شده است. قابل ذکر است که تمام مواد و محلول هایی که در این بیورآکتور مورد استفاده قرار گرفت از قبل اتوکلاو شدند تا از هرگونه آلودگی داخلی جلوگیری گردد. هم چنین کابین قبل از استفاده توسط مواد شیمیایی اکسید کننده و سفید کننده تمیز شده و پس از آن با بهره گرفتن از الکل ضدعفونی گردید.
شکل ۳-۴: نمایی از بیورآکتور سینی دار مورد استفاده در تخمیر حالت جامد
شکل ۳-۵: شماتیکی از بیورآکتور سینی دار مورد استفاده
۳-۸- تخمیر حالت جامد
نمونه های ۳ گرمی باگاس در داخل بسته هایی از کاغذ صافی بر روی سینی بالایی و میانی قرار گرفت. کاغذ صافی ها به دو دلیل مورد استفاده قرار گرفتند اول اینکه نمونه گیری و استخراج محصول راحت تر باشد و دیگر این که در هنگام نمونه گیری مشخص باشد که از چه مقدار باگاس به چه مقدار پروتئین دست یافته شد. محلول حاوی مخمر که به مدت ۲۴ ساعت در داخل انکوباتور شیکر با دمای ۳۰ درجه سانتی گراد دورrpm ۱۵۰ آماده شد بود به طور یکنواخت بر روی سطح باگاس در دوسینی توزیع شد. به منظور فراهم آوردن شرایط مناسبی از لحاظ رطوبت در داخل بیورآکتور، محلول محیط کشت موجود در سینی پایینی که حاوی ۱۰۰۰ میلی لیتر محلول با ترکیب درصد g/l ۱ عصاره مخمر و g/l ۲/۰ پتاسیم دی هیدروژن فسفات بود بر روی سینی بالایی توزیع شد. پس از آن از منافذ موجود در در سینی پایینی عبور کرده و بر روی نمونه های موجود در سینی میانی ریخته شد و در نهایت به منبع اصلی خود (سینی پایینی) رسید. این چرخش مایع در داخل بیورآکتور تا زمانی ادامه داشت که نمایشگر کنترلر رطوبت عدد تنظیم شده را نشان دهد. در واقع با کارهای انجام شده دو هدف مجزا پیگیری شد: اول این که حضور مایع در داخل سیستم، محفظه داخلی بیورآکتور را همواره مرطوب نگه می داشت. دوم این که محلول موجود در سینی پایینی مواد مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم (غیر از موادی که در باگاس موجودند) را در اختیار آن ها قرار می داد و از این رو سبب تسریع در رشد میکروارگانیسم می گشت. در شکل های ۳-۶ و ۳-۷ نوع قرارگیری سوبسترا بر روی سینی ها نشان داده شده است.
شکل ۳-۶: کاغذ صافی حاوی نمونه باگاس
شکل ۳-۷: نحوه قرار گیری سوبسترا بر روی سینی ها
۳-۹- نمونه گیری و استخراج پروتئین
نمونه های ۳ گرمی تخمیر یافته به منظور اندازه گیری پارامترهای مختلف به فواصل زمانی ۲۴ ساعت مورد بررسی قرار گرفتند. برای اندازه گیری پارامترها،نمونه های جامد تخمیر یافته می بایست به محیط مایع انتقال یابد. بدین منظور نمونه های جامد در بافر استخراج پروتئین ریخته و به مدت ۲ ساعت در انکوباتور شیکر با دمای °C۳۰ و دور rpm۲۰۰ قرار داده شد تا تمام پروتئین به فاز مایع منتقل شود. پس از آن به کمک پمپ خلا‌ء سوسپانسیون فوق فیلتر گردید و محلول فیلتر شده به مدت ۲۰ دقیقه درون سانتریفیوژ با ۶۰۰۰ دور در دقیقه قرار داده شد. از آنجایی که در مایع سینی آخری فاز جامد موجود نبود این مایع به طور مستقیم بدون انجام مراحل ذکر شده برای اندازه گیری پروتئین مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۱۰- محاسبه میزان خاکستر
ابتدا بوته چینی توزین، سپس یک گرم سوبسترای جامد (باگاس نیشکر) که از قبل درون آون خشک شد داخل بوته چینی ریخته شد. مجموع بوته چینی و نمونه برای مدت دو ساعت داخل کوره ای با دمای ۶۰۰ درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از سرد شدن وزن مجموع بوته و خاکستر اندازه گیری شده و در نهایت میزان خاکستر از رابطه ۳-۱ به دست آمد ]۶۲[:
(۳-۱) (وزن سوبسترا( /(وزن بوته چینی_وزن مجموع بوته و خاکستر نهایی) × ۱۰۰₌ درصد خاکستر
۳-۱۱- محاسبه میزان رطوبت
ابتدا شیشه ساعت توزین شد، سپس وزن دلخواهی از سوبسترای جامد داخل شیشه ساعت ریخته و مجموع شیشه ساعت و سوبسترای جامد وزن گردید.پس از آن مجموع شیشه ساعت و سوبسترا در درون آون در دمای ۱۰۵ درجه سانتی گراد قرار گرفت. در بازه های زمانی معین، این مجموعه از آون خارج شده و توزین گردید. زمانی که تغییرات وزن آن ها به صفر رسید، وزن نهایی اندازه گیری شد. میزان رطوبت از فرمول ۳-۲ محاسبه گردید ]۶۲[:
) ۳-۲( (وزن جامد) / (مجموع وزن نهایی ـمجموع وزن اولیه شیشه ساعت و جامد) × ۱۰۰₌ درصد رطوبت
۳-۱۲- محاسبه میزان قند
برای اندازه گیری قند از روش DNS استفاده شد. این روش نیاز به تهیه معرف و ترسیم منحنی استاندارد می باشد.
۳-۱۲-۱- اندازه گیری قند به روش DNS
اساس این روش بر مبنای اکسیداسیون گروه آلدهید منوساکارید‌های آلدوزی می‌باشد. به طور همزمان ۳و۵-دی نیترو سالیسیلیک اسید^[۶۹] (DNS) تحت شرایط قلیایی به ۳-آمینو، ۵-نیتروسالیسیلیک اسید احیا می‌شود.اگر چه، در این فرایند واکنش‌های جانبی زیادی وجود دارد،اما، نوع واکنش به طبیعت قند‌های کاهنده بستگی دارد. قند‌های کاهنده متفاوت معمولاً شدت رنگی متفاوتی دارند. بنابراین، ضروری است تا برای هر قند، کالیبراسیون خاص آن قند صورت گیرد.
در این روش ابتدا محلول معرف قندی تهیه شد. برای این منظور ۱۰ گرم دی نیترو سالیسیلیک اسید، ۵/۰ گرم سولفیت سدیم و ۱۰ گرم هیدروکسیدسدیم در یک بالن یک لیتری ریخته و با آب مقطر به حجم نهایی (یک لیتر) رسانده شد. محلول به دست آمده به کمک دستگاه همزن مغناطیسی کاملاً همگن شد. هم چنین، برای تهیه محلول تثبیت واکنش، ۴۰۰ گرم سدیم پتاسیم تارتارات را در ۱۰۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حرارت داده تا کاملاً حل شود ]۶۳[.
برای استفاده از معرف قند باید منحنی استاندارد قند مربوط به این معرف ترسیم گردد. این منحنی استاندارد که به صورت خطی می‌باشد، با تأثیرات این معرف بر غلظت‌های مختلفی از هر قند به دست می‌آید. سپس در طول آزمایش با مراجعه به این منحنی استاندارد و استفاده از روش طیف‌سنجی نوری می‌توان غلظت قند را محاسبه نمود. این روش با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر و بر پایه جذب در طول موج ۵۴۰ نانومتر انجام می‌شود (شکل ۳-۸). به این صورت که ابتدا باید دستگاه را با محلول شاهد (محلولی که مبنای اختلاف نمونه‌های آزمایشی باشد) کالیبره کرد. سپس می توان با قرار دادن نمونه مورد آزمایش در دستگاه، میزان جذب آن را با در نظر گرفتن اختلاف با شاهد به دست آورد.

شکل ۳-۸: محلول DNS و دستگاه اسپکتروفتومتر مورد استفاده در این پروژه
۳-۱۲-۲- تهیه منحنی استاندارد قند
برای تهیه منحنی استاندارد قند ابتدا به طور جداگانه محلول‌هایی با غلظت‎‌های متفاوتی از گلوکز (از غلظت ۴/۰ تا ۲ گرم بر لیتر) ساخته شد. سپس به هر یک از لوله‌های آزمایش، به طور جداگانه ۱ میلی‌لیتر از هر محلول گلوکز به همراه ۱ میلی‌لیتر معرف قند اضافه گردید. برای تهیه محلول شاهد نیز در لوله‌ی آزمایش دیگری، ۱ میلی‌لیتر آب مقطر و ۱ میلی‌لیتر از محلول معرف اضافه شد.همه‌ی لوله‌ها برای مدت ۱۵ دقیقه در آب جوش و بعد از آن بلافاصله به مدت ۵ دقیقه درحمام آب یخ قرار گرفتند، سپس به هر لوله ۸ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۴۰ نانومتر میزان جذب مربوط به هر غلظت خوانده شد. در نهایت نمودار غلظت قند مطابق با شکل ۳-۹ بر حسب میزان جذب ترسیم شد. معادله خطی بهصورت معادله ۳-۳ برآورد گردید که با بهره گرفتن از آن غلظت قند در میزان جذب‌های مختلف محاسبه شد.
(۳-۳) ۰۱۱/۰ –x ۴۹۵/۰ y =
که در آن، x، غلظت قند برحسب گرم بر لیتر، y، میزان جذب در۵۴۰ نانومتر می باشد.
شکل ۳-۹: منحنی استاندارد گلوکز جهت سنجش میزان قند در طول موج ۵۴۰ نانومتر
۳-۱۳- محاسبه اسیدیته چربی
در ابتدا به ۵۰ میلی لیتر اتانول، ۱ میلی لیتر شناساگر فنول فتالئین اضافه نموده و محلول فوق در یک ارلن حرارت داده شد. زمانی که دمای اتانول به بالاتر از ۷۰ درجه سانتی گراد رسید با محلول پتاسیم هیدروکسید با غلظت مشخص خنثی گردید. نقطه پایان با ثابت ماندن رنگ ارغوانی مشخص شد. سپس مقدار مشخصی از نمونه به اتانول اضافه شد و محلول در حال جوش با پتاسیم هیدروکسید خنثی گردید. عدد اسیدی از فرمول ۳-۴ محاسبه می شود (در تمام مراحل فوق محلول به صورت یکنواخت هم زده می شود):
(۳-۴) (وزن نمونه) /(غلظت محلول پتاسیم هیدروکسید ×حجم پتاسیم هیدروکسید × ۱/۵۶)₌عدد اسیدیته
۳-۱۴- تعیین درصد مواد استخراجی
اندازه ­گیری مقدار مواد استخراجی محلول در اتانول- استون طبق آئین­نامه T204 cm-97 استاندارد TAPPI انجام گرفت ]۶۴[. ابتدا ۵ گرم پودر بر مبنای وزن خشک داخل کارتوش ریخته و کارتوش داخل سوکسوله ۲۵۰ میلی­لیتری گذاشته شد. سپس ۲۰۰ میلی لیتر محلول اتانول- استون با نسبت ۲:۱ داخل بالن ۵۰۰ میلی­لیتری ریخته و سوکسوله بر روی بالن و مبرد بر روی سوکسوله و مجموعه روی اجاق برقی قرار گرفت و جریان آب سرد برقرار گردید (شکل ۳-۱۰). حرارت طوری تنظیم شد که هر ساعت ۴ بار سیفون انجام شود. بعد از گذشت ۸ ساعت حلال بازیابی شد و محتویات بالن صاف شد. سپس کاغذ صافی در آون با حرارت ۱۰۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳ ساعت قرار گرفت تا خشک شود. بعد از آون، کاغذ صافی به دسیکاتور منتقل و پس از سرد شدن توزین شد. درصد مواد استخراجی با فرمول ۳-۵محاسبه شد:
(۳-۵) (وزن اولیه پودر/ وزن مواد استخراجی خشک) × ۱۰۰₌ درصد مواد استخراجی
شکل ۳-۱۰: دستگاه سوکسوله برای اندازه گیری مواد استخراجی
۳-۱۵- تعیین درصد سلولز