مرحله ۴ ،(مرحله رسوب گذاری) دوباره تکرار شد. هدف خارج کردن باقی مانده SDS از LPS تهیه شده است.
۵)
اضافه نمودن(۹ml(Tris-HCL 10mM pH=7/4 و همچنین اضافه نمودن (Sigma DN25-10MG))DNase(100µg/ml ml5/0 و اضافه نمودن ml RNase(25µg/ml)5/0 (به این صورت که از استوک µg/mlRNase25 حدود ۲۵/۱میکرولیتر برداشته و در ۱۰۰۰ میکرولیترآب مقطر حل شد و سپس از این استوک ۵/۰میلی لیتر برداشته و به مخلوط اضافه شد). مخلوط فوق سپس جهت هضم و تخریب نوکلئیکاسیدها به مدت ۴ساعت در دمای ۳۷درجه نگهداری شد.
۶)
مخلوط پس از اتمام انکوبه در بن ماری (دمایC ˚ ۶۵) به مدت۳۰ دقیقه قرار گرفت.
فنل۹۰% هم حجم مخلوط اضافه شد و سپس به آرامی۱۰ الی ۱۵ بار اینورت گردید. (فنل به صورت کریستاله بوده که برای تهیه ۹گرم در ۱۰سیسی و یا ۹۰ گرم در ۱۰۰ سیسی حل شد).
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
در بن ماری (دمایC ˚۶۵) به مدت ۱۵ دقیقه قرار گرفت.
سپس در حمام یخ دمایC ˚۴ درجه به مدت ۵دقیقه قرار داده شد.
۷)
مخلوط فوق به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت rpm4000 سانتریفیوژ گردید.
محلول رویی دور ریخته شد و فاز فنلی نگهداری گردید.(LPS در فاز فنلی موجود است)
فاز فنل با سمپلر کشیده شد و به فالکون تمیز منتقل شد سپس هم حجم آن آب مقطر اضافه شد.
به مدت ۲روز دیالیز انجام شد.
(مخلوط فوق در داخل کیسه منفذدار ریخته و دو طرف آن به خوبی با نخ بسته شد چون نباید داخل کیسه هوا باشد به خاطر اینکه تبادل مایع داخل کیسه و بافردیالیز بهتر و با سرعت بیشتر صورت گیرد، ولی زمانی که هوا باشد سرعت تبادل را خیلی خیلی پایین خواهد آمد. در داخل بشر که حاوی بافر دیالیز(محلول دیالیز- جدول شمارهII) است قرار داده و دو طرف نخ را به بشر چسب زده شد تا اینکه در وسط محلول بافر دیالیز ثابت بماند اما نه اینکه کاملا در محلول فرو رود (تا جایی که مشخص شود محلول داخل کیسه و بافر با هم تبادل دارند). بعد طی زمان مشخص شده هر ۲۰ یا ۳۰ دقیقه یکبار از بافر دیالیز داخل بشر(محلولی که تبادل صورت میگیرد) برداشته و OD های مختلف از ۲۸۰ و بقیه OD ها خوانده شد. در اینجا برای بلانک از بافر دیالیزی که دست نخورده استفاده شد. بعد از مدتی که دیده شد OD تغییر چندانی نداشته یعنی تبادلی صورت نگرفته(اشباع شده)، بایستی بافر دیالیز عوض شود.(تقریبا هر دو یا سه ساعت محلول بافر دیالیز عوض شد.)
زمانی که بافر جدید هم اضافه شد OD ها در زمانهای مختلف خوانده شد و این مراحل تکرار گردید تا زمانی که بافر جدیدی که اضافه شد و OD های بافرهای که در زمان های های مختلف بررسی و مشاهده شد تغییری در آن صورت نگرفته در نتیجه بافر کارش را انجام داده است. بعد از این مراحل و برای حصول اطمینان از صحت کار بافر بشر به مدت چند ساعت داخل یخچال گذاشته شد تا اینکه هیچ شک و شبهای نداشته و OD آن ثابت شد و فرایند انجام شده است.
در این مدت بشر از ابتدا بر روی Hot Plate قرار گرفت. البته دمای آن خاموش و فقط شیک با مگنت rpm350-250(set speed rpm) روشن میباشد به این دلیل که بافر دیالیز یکنواخت شود. (برای این مطالعه این مرحله ۲ روز زمان صرف شد و هر ۲ یا ۳ ساعت بافر دیالیز عوض شد. این مراحل متغیر است).بعد از این مراحل محتوی داخل کیسه را به فالکون جدید و استریل انتقال یافت.
LPS بدست آمده در داخل یخچال نگهداری شد. البته میتوان با لیوفیلیز کردن در دمای اتاق نیز نگهداری نمود.بعد انجام این مراحل برای اینکه از LPS تخلیصی اطمینان حاصل شود و غلظت بهتری جهت SDS-PAGE بدست آید مراحل زیر انجام شد.
-
- ۵میلیلیتر از LPS تخلیص شده اول برداشته و به داخل فالکون جدید انتقال یافت(روی یخ قرار گرفت تا سرد بماند)و به آن ۵/۲ میلی لیتر متانول سرد اضافه شد و به آرامی هم زده شد. سپس فالکون از روی یخ برداشته و به مدت ۴ساعت در یخچال نگهداری شد بعد از آن میزان رسوب مورد بررسی قرار گرفت.
-
- دوباره ۵/۲میلی لیتر متانول سرد مانند قبل اضافه شد و پس از مخلوط شدن در یخچال به مدت یک شب(۱۶ساعت) نگهداری شد. سپس صبح روز بعد رسوب مشاهده گردید.
-
- به مدت ۱۰ دقیقه در rpm4000 سانتریفیوژ شد و محلول رویی دور ریخته شد و رسوب نگهداری گردید.(رسوب نشان دهنده وجود LPS)
-
- رسوب خشک شده و ۵۰۰میکرولیتر بافر فسفات(جدول شمارهII) به رسوب افزوده و چند بار ضربه باعث شد تا خوب حل شود. LPS) آماده استفاده برای SDS page).
تهیه محلول شمارهI
Tris-Hcl(10mM (pH=8)) 1.57g
(SDS %2)2g
(۴cc)2مرکاپتواتانول%۴
MgCL2(2mM)
for 100cc
برای حجم۱۵ میلی لیتر
(( محلول شمارهI ))
| MgCL2 | ۲مرکاپتواتانول | SDS | (Tris-Hcl buffer) pH =8 |
| ۰.۰۰۲۸۲ g | ۶۰۰µl (0.6cc) | ۰.۳ g | ۰.۰۱۸۱ g |
ابتدا تریس را وزن کرده و در یک ظرف با ۷میلی لیتر آب مقطرحل شد ، سپس pHمتری نموده۸=pH (حتما بایستی اول pHمتری تریس انجام شود در غیر اینصورت مقدار pHبیشتر خواهد شد). سپس بقیه مواد فوق را اضافه و بعد با آب مقطر به حجم ۱۵میلی لیتر رسانده شد.
۳-۱۹-۲ تهیه محلول دیالیز یا بافر فسفات
((محلول شمارهII))
