1. 1. TRI^® reagent

 

1. 1. 2-propanol

 

1. 1. DNase I Buffer

 

1. 1. First strand cDNA synthesis kit

 

1. 1. EDTA

 

1. 1. UltraPure^TM Agarose

 

1. 1. Tris (Trizma base)

 

1. 1. PBS

 

1. 1. DMEM

 

1. 1. 6X DNA Loading Dye

 

1. 1. DNA Ladder 50 bp

 

1. 1. Ethidium Bromide (10mg/ml)

 

1. 1. dNTP Mix 10mM

 

1. 1. MgCl₂ 50mM

 

1. 1. SmarTaq^TM DNA Polymerase

 

1. 1. Power SYBR Green PCR Master

 

1. 1. PI

 

1. 1. miScript Reverse Transcription Kit

 

1. 1. miScript SYBR Green PCR Kit

 

1. 1. TUNEL Kit

 

شیوه انجام کار
به منظور بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو بر بیان ژن Kdm5d، ابتدا میزان درصد رادیکال­های آزاد درون بافت­های بیضه نرمال و تیمار شده توسط فلوسایتومتری سنجیده شد، سپس میزان بیان این ژن از طریق تکنیکReal time PCR مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، میزان شکست DNA هم به­روش TUNEL با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت سنجیده شد.
در ادامه به چگونگی انجام هر روش به تفصیل پرداخته می­ شود.
3-1- تعیین گروه های آزمایشی
نمونه­های مورد مطالعه در این تحقیق شامل نمونه­های کنترل (تزریق شده با آب) و نمونه های تیمار (تزریق شده با t-BHP) بودند. مقدارکل نمونه در این تحقیق 10 مورد و تعداد نمونه درهر گروه 5 مورد بود.
3-2- جمع آوری نمونه­ها و محل انجام آزمایش
ابتدا موش­های نر بالغ (8-10 هفته­ای) با نژاد Balb/C از انستیتو پاستور دریافت شد. علت انتخاب اين گونه، وجود شباهت­هاي ژنتيکي، فيزيولوژيکي و توليدمثلي ميان موش و انسان، سادگي، سرعت تکثير و سهولت در نگهداري و پرورش آنها بود. سپس در حيوانخانه پژوهشگاه رويان، با شرايط دمايي C° 25-20 و دوره 12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريکي و نيز دسترسي آسان به آب و غذا نگهداري شدند. جهت حذف استرس ناشي از حمل و نقل و تطبيق حيوانات با محيط جديد، يک هفته قبل از شروع آزمايش، موش‌ها به محل نگهداري منتقل شدند.
3-3- القاء استرس اکسيداتيو با تزريق t-BHP
Kaur و همکاران نشان دادند که تزريق يک‌دهم برابرِ ميزانِ دوز کشنده 50‌درصد (LD₅₀)، از ماده t-BHP به مدت 14 روز به موش‌­ها، مي‌تواند سبب القاء استرس اکسيداتيو شود(Shapiro, 2005).
فاطمی و همکاران، LD₅₀ برای t-BHP را با مقادير 400، 500 و 600 ميکرومول به ازاء هر 100 گرم وزن بدن تعیین کردند. ابتدا موش­ها وزن شدند و از همان ابتدا به دو گروه کنترل و تیماری تقسیم شدند، سپس طي يک دوره چهارده روزه (بين ساعت 10-12) به صورت داخل صفاقي تزریق صورت گرفت. به منظور شبیه سازی اثر استرس احتمالي ناشي از تزريق، به گروه کنترل آب مقطر تزريقي به مدت 14 روز تزريق گرديد. در مدت زمان تزريق، وزن موش­ها 4 مرتبه اندازه­گيري شد. پس از گذشت 14 روز، موش­ها به روش جابجايي مهره هاي گردن^[37] کشته شدند و وزن بافت بيضه در هر دو گروه کنترل و آزمون، گزارش گرديد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

3-4- تک سلول کردن بافت بيضه
ابتدا محلول آنزيمي شامل ديسپاز^[38] (1 میلی­گرم در میلی­لیتر)، کلاژناز^[39] (1 میلی گرم در میلی­لیتر) و هيالورونيداز^[40] (1 میلی­گرم در میلی­لیتر) به ازاي هر بافت، 4 ميلي­ليتر تهيه شد. پس از کشتن حيوان، بافت بيضه جدا شده و در پليت حاوي PBS قرار گرفت. با کمک دو پنس، کپسول بيضه پاره شد و محتويات آن به پليت حاوي DMEM انتقال يافت. پس از خرد کردن بافت، مخلوط حاصله 1 دقيقه با دور 1000 rpm سانتريفوژ شد. مايع رويي خارج و به رسوب 2 ميلي­ليتر محلول آنزيمي اضافه شد و به مدت 10 دقيقه پيپت شد تا لوله­ها باز شوند (پليت در تمام مدت روي صفحه گرم^[41] قرار داشت). پس از آن محيط و بافت، مجددا̋ با همان شرايط قبل سانتريفوژ شدند. اين بار نيز مايع رويي خارج، مجدد 2 ميلي­ليتر آنزيم اضافه شد و 15 دقيقه پيپت شد. سپس 2 ميکروليتر IDNase (غلظت نهایی1میکرولیتر در هر میلی­لیتر) اضافه شد و در انکوباتور قرار گرفت. به دنبال اطمينان از باز شدن لوله­ها زير ميکروسکوپ، آنزيم با DMEM حاوي 15% FBS خنثي شد. در نهايت سوسپانسيون از فيلتر 40 ميکرومتري عبور داده شد.
3-5- شمارش تعداد سلول­هاي زنده در بافت بيضه
پس از تک سلول کردن بافت بيضه، 7 میکرولیتر تريپان­بلو (4/0%) با 7 میکرولیتر از سوسپانسيون سلولي مخلوط شد و روي لام نئوبار قرار گرفت و با ميکروسکوپ معکوس^[42] شمارش سلول­ها انجام شد. اين لام به صورت يک صفحه شطرنجي شکل با چهار خانه بزرگ در گوشه­هايش است (شکل 3-1). سلول­هاي فاقد رنگ درون اين چهارخانه را شمرده و مجموع آنها بر چهار تقسيم مي­شود تا ميانگين بدست آيد. آنها در مقدار ميلي­ليتر موجود در محيط کشت ضرب مي­شوند که 5 ميلي­ليتر است و سپس ضربدر ضريب رقت که 2 است و در آخر در ده به توان چهار (که يک عدد نرمالايز شده است) ضرب مي­شوند و عدد حاصل، به عنوان تعداد سلول­هاي زنده موجود در محيط کشت گزارش مي­شود.
شکل (3-1): شمايي از لام نئوبار
3-6-1- روش فلوسايتومتري^[43]
از جمله روش‌هاي اندازه‌گيري انواع واکنش‌پذير اکسيژن، فلوسايتومتري می­باشد. فلوسايتومتري تکنولوژي است که به طور همزمان چندين ويژگي فيزيکي ذرات (عموما سلول­ها) را اندازه گيري و سپس آناليز مي­نمايد. خصوصيات قابل اندازه­گيري شامل اندازه نسبي ذرات، مجزا بودن يا پيچيدگي ذاتي و شدت نسبي فلورسنس آنها مي­باشد. اين ويژگي­ها با کاربرد يک سيستم نوري-الکترونيکي تعيين مي­شوند که گزارش مي­کند چگونه سلول نور ليزر را جذب و فلورسنس از خود ساطع مي­کند. يک فلوسايتومتر از سه سيستم اصلي مايع، نور و الکترونيک تشکيل شده است.
سيستم مايع، ذرات را به سمت پرتوي ليزر جهت بررسي انتقال مي­دهد.

 

• • سيستم نوري، حاوي ليزر­هايي براي درخشان ساختن ذرات موجود در نمونه مي­باشد و فيلترهاي نوري سيگنال­هاي نور ايجاد شده را به سمت آشکارسازهاي^[44] مناسب هدايت مي­کند.

 

• • سيستم الکترونيک، سيگنال­هاي نوري شناسايي شده را به سيگنال­هاي الکتروني تبديل مي­کند که توسط کامپيوتر پردازش مي­گردد.

 

در اين تکنيک ذرات يا سلول­هايي با اندازه 150-2/0 ميکرومتر براي آناليز مناسب مي­باشند. در صورت استفاده از بافت، سلول­هاي موجود در آن ابتدا بايد تفکيک گردند و سپس مورد بررسي قرار گيرند(Shapiro, 2005).
در اين روش از پروب‌هاي فلوئورسنت نظير 2 و 7 – دي‌کلروفلئورسين دي‌استات^[45](DCFH-DA) استفاده مي‌شود. مزيت اين روش اين است که اولا ميزان ROS داخل سلولي را در تک تک سلول‌ها مي‌سنجد، ثانيا بين سلول‌ها و جمعيت‌هاي غيرسلولي تفکيک قائل مي‌شود، همچنین قابليت اندازه‌گيري ROS را در جمعيت‌هاي زياد اسپرمي دارد. به علاوه مراحل آماده‌سازي و اندازه گيري به سرعت قابل انجام است(Lampiao et al., 2006). DCFH-DA با حل شدن در غشاء ليپيدي به داخل سلول نفوذ مي‌کند. در داخل سلول، گروه استات آن توسط آنزيم استراز^[46] جدا و به دي‌کلروفلئورسين (DCFH)، تبديل مي‌شود. DCFH قابليت خروج از سلول را ندارد و هنگاميکه توسط انواع ROS، اکسايش مي‌يابد به رنگ سبز فلوئورسنتِ DCF تبديل مي‌شود(Lampiao et al., 2006).(شکل 3- 2).

شکل (3-2): DCFH-DAو مکانيسم عمل آن (Lampiao, Strijdom, & Du Plessis, 2006)
پروب ديگري که در اين روش استفاده مي شود، دي هيدرو اتيديوم (DHE) است که توسط آنیون سوپراکسید داخل سلولي به اتيديوم برمايد تبديل مي­شود. در داخل سلول اين ترکيب به DNA متصل شده و رنگ فلورسنت قرمز را منتشر مي­نمايد. DCFH-DA و DHE به ترتيب، پروب اختصاصي جهت شناسايي H₂O₂ و O₂^-• مي­باشند( Mahfouz, R. et al., 2010).
3-6-2- سنجش ROS در بيضه بوسيله فلوسايتومتري
سلول­هاي بافت بيضه جهت سنجش ROS مورد استفاده قرار گرفتند. ميزان ROSدر اين سلول­ها پس از کشتن حيوان و تک سلولی کردن سلول­های بیضه سنجيده شد. براي سنجش ROS توسط فلوسايتومتري، از رنگ­هاي DCFH-DA و DHE استفاده شد که به ترتيب اختصاصي جهت اندازه گيري H₂O₂ و ^°¯ O₂مي­باشند. اين رنگ­ها قادر به عبور از غشاي سلول بوده و در مـواجه با ROS درون سلولي اکسيـد مي­شوند. DCFH-DA پس از اکسيد شدن با H₂O₂ به (^[47]DCF) تبديل مي­شود و DHE توسط ^°¯O₂ به^[48]HE ، يکي از مشتقات اتيديوم برومايد، اکسيد مي­شود. اکسايش اين ترکيبات توسط عوامل اکساينده و انواع واکنش­پذير اکسيژن، سبب ايجاد يک ترکيب فلورسنت در محدوده نور سبز و قرمز مي‌شود (طول موج رنگ سبز بين 500 و 530 نانومتر و رنگ قرمز بين 590 و 700 نانومتر مي­باشد). رنگ‌آميزي سلول‌ها به شرح زير انجام شد: